Oryctolagus cuniculus Kimozin Enzimini Pichia pastoris Mayasında İfade Edecek Vektörün Dizayn ve Jenerasyonu

Authors : SELİN ALİHANOĞLU, Meral ATLI, Hasan VARDİN, Mehmet KARAASLAN

Pages : 26-34

View : 16 | Download : 5

Publication Date : 2018-10-28

Article Type : Research Paper

Abstract :Bu çalışmada rekombinant tavşan pro-kimozin genini üretmek amacıyla kullanılacak olan pPIC9K-Chy vektörünün dizayn edilmesi ve çoğaltılması hedeflenmektedir. DNA bilgi bankalarında biyoinformatik analizler yapılarak tavşan pro-kimozin gen dizilimi belirlenmiştir. Elde edilen dizilimlere göre dizayn edilen primerler ile tavşandan genomundan kimozin enzimi izole edilmiştir. Hedef DNA sekansları PIC9K vektörüne EcoRI ve NotI restriksiyon enzimleriyle üzerinden klonlanmıştır. Klonlama işlemi sonrasında hedef geni içeren vektör, JM109 kompetent E. coli hücrelerine ısı şoku uygulamasıyla transforme edilmiş ve antibiyotikli besiyerinde seçilimleri gerçekleştirilmiştir. Antibiyotik pozitif olan tek kolonilerin hedef geni taşıyıp taşımadıkları koloni PZR yöntemiyle doğrulanmış ve E. coli hücrelerinden plazmid DNA’lar ekstrakte edilmiştir. Elde edilen plazmid DNA' lar elektroporasyon yöntemi ile Pichia pastoris kompetent maya hücrelerine aktarılmış ve aktarılan hücreler çeşitli konsantrasyonlarda antibiyotik içeren besi yerlerine ekilerek hedef geni taşıdıkları doğrulanmıştır.
Keywords : Tavşan, Kimozin, Pichia pastoris, Rekombinant kimozin, pPIC9K